Thèse Année : 2024

Multifaceted role of SUMOylation in maintaining centromere biology and regulation of replication fork restart in Schizosaccharomyces pombe

Rôle multifacette de la SUMOylation dans le maintien de la biologie du centromère et la régulation du redémarrage des fourches de réplication chez Schizosaccharomyces pombe

Shrena Chakraborty
  • Fonction : Auteur
  • PersonId : 1491483
  • IdRef : 282664750

Résumé

Flaws in the DNA replication process, known as replication stress, is a major source of genome instability that fuels cancer development. Resolution of replication stress occurs within a compartmentalized nucleus that exhibits distinct DNA repair capacities. In different eukaryotic organisms, stressed replication forks (RFs) shift to the nuclear periphery for anchorage to the nuclear pore complexes (NPCs), a highly conserved structure in the nuclear envelope that act as docking sites to allow alternative DNA repair pathways to occur. These changes in nuclear positioning is regulated by the small ubiquitin-like modifier (SUMO) metabolism, which is pivotal to spatially segregate the activities of the homologous recombination (HR) pathway. Our previous work in the fission yeast Schizossacharomyces pombe, has established that a replication fork blocked by a DNA-bound protein relocates and anchors to NPC in a SUMO-dependent manner. SUMO chains trigger the relocation of single arrested forks to the nuclear periphery to anchor to the NPC. This anchorage requires the SUMO chains and the SUMO-targeted ubiquitin ligase (STUbL), Slx8 pathway. However, SUMO chains also limit the Recombination-Dependent Replication (RDR) pathway, necessary to promote fork restart. These SUMO conjugates can be cleared off by the SENP protease Ulp1 and the proteasome, whose activities are enriched at the nuclear periphery. Thus, a routing towards NPCs allows HR-dependent replication restart by counteracting the toxicity of SUMO chains. Since, both SUMO chain formation and the Slx8 STUbL pathway were crucial for NPC routing of arrested replication forks. My thesis project initially focused on unraveling if the Slx8 STUbL can be exploited as a readout of damage-induced SUMO chains. To do so, I tagged Slx8 with a GFP tag and monitored them using the fluorescence microscopy technique. Unexpectedly, I was unable to detect replication stress-induced Slx8 foci. However, I discovered that Slx8 forms a single nuclear focus, enriched at the nuclear periphery, which marks both clustered centromeres at the spindle pole body and the silent mating type region. The formation of this single Slx8 focus requires the E3 SUMO ligase Pli1, poly-SUMOylation and the histone methyl transferase Clr4 that is responsible for the heterochromatin histone mark H3-K9 methylation. Finally, it was established that Slx8 promotes centromere clustering and gene silencing at heterochromatin domains. Altogether, my data highlight evolutionarily conserved and functional relationships between STUbL and heterochromatin domains to promote gene silencing and nuclear organization. Additionally, I have better characterized pathways of fork restart within the nuclear space. The team previously established that arrested RFs require SUMO chains and the strand exchange activity of Rad51 for routing to the NPC for subsequent fork restart. In this context, I unveiled the existence of an alternate fork restart pathway that occurs by mono-SUMOylation, in the nucleoplasm when forks do not shift to the NPC, as SUMO chains are not formed. Here, I revealed that fork restart within the nucleoplasm still depends on the strand exchange activity of Rad51 largely, while the single strand annealing (SSA) activity of Rad52 plays an important role in mediating error-prone fork progression in the absence of SUMO chains. Taken together, my results suggest two different ideas about SUMOylation. One part underscores how Slx8 STUbL-regulated SUMOylation promotes centromere clustering and gene silencing at heterochromatin domains. Whereas, the other section elucidates the “SUMO control” on the spatially segregated, alternative pathways of fork restart within the nuclear space. Therefore highlighting the importance of maintaining SUMO balance for preserving genome integrity.
Les défauts dans le processus de réplication de l'ADN, connus sous le nom de stress de réplication, sont une source majeure d'instabilité du génome qui favorise le développement du cancer. La résolution du stress de réplication se produit dans un noyau compartimenté qui présente des capacités distinctes de réparation de l'ADN. Les fourches de réplication stressées présentent une mobilité accrue et se déplacent vers la périphérie du noyau pour s'ancrer aux complexes du pore nucléaire, une structure hautement conservée de l'enveloppe nucléaire qui agit comme un site d'amarrage pour permettre à d'autres voies de réparation de l'ADN de se mettre en place. Ces changements dans le positionnement nucléaire sont régulés par le métabolisme des petits modificateurs de type ubiquitine (SUMO), qui jouent un rôle essentiel dans la ségrégation spatiale des activités de la voie de la recombinaison homologue (RH). Nos travaux antérieurs chez la levure de fission ont établi qu'une fourche de réplication bloquée par une protéine liée à l'ADN se relocalise et s'ancre au NPC d'une manière SUMO-dépendante. Les chaînes SUMO déclenchent la relocalisation des fourches arrêtées à la périphérie du noyau pour s'ancrer au NPC. Cet ancrage nécessite les chaînes SUMO et la voie de l'ubiquitine ligase ciblée par les SUMO (STUbL) Slx8. Cependant, les chaînes Cependant, les chaînes SUMO limitent également la voie de redémarrage de la fourche. Ces conjugués SUMO peuvent être éliminés par la protéase SENP Ulp1 et le protéasome, dont les activités sont enrichies à la périphérie nucléaire. Ainsi, une relocalisation vers les NPCs permet un redémarrage de la réplication dépendant de la RH en contrecarrant la toxicité des chaînes SUMO. La formation de chaînes SUMO et la voie Slx8 étant cruciales pour la relocalisation des fourches de réplications bloquées au NPC. Mon projet s'est d'abord attaché à déterminer si Slx8 STUbL pouvait être exploitée en tant que marqueur des chaînes SUMO induites par des dommages à l’ADN. Pour ce faire, j'ai marqué Slx8 avec une étiquette GFP et j’ai suivi le marquage GFP par microscopie à fluorescence. De manière inattendue, je n'ai pas pu détecter de foyers Slx8 spécifiquement induits par le stress de réplication. Cependant, j'ai découvert que Slx8 forme un foyer nucléaire unique, enrichi à la périphérie nucléaire, qui marque à la fois les centromères groupés au niveau du centre organisateur des microtubules et la région silencieuse du mating type. La formation de ce foyer unique de Slx8 nécessite la ligase E3 SUMO Pli1, la poly-SUMOylation et l'histone méthyl transférase Clr4 qui est responsable de la méthylation de l’histone H3K9 qui marque l'hétérochromatine. Enfin, j'ai établi que Slx8 favorise le regroupement des centromères et le silencing des gènes dans les domaines de l'hétérochromatine. Dans l'ensemble, mes données mettent en évidence des relations fonctionnelles et conservées au cours de l'évolution entre STUbL et les domaines de l'hétérochromatine pour promouvoir le silencing des gènes et l'organisation nucléaire. En outre, j'ai mieux caractérisé les voies de redémarrage des fourches bloquées dans l'espace nucléaire. L'équipe a précédemment établi que les fourches arrêtées nécessitent l'activité d'échange de brins de Rad51 pour être acheminées vers le NPC en vue d'un redémarrage. Dans ce contexte, j'ai dévoilé l'existence d'une voie alternative de redémarrage qui implique la mono-SUMOylation, dans le nucléoplasme en absence de relocalisation au NPC. Ici, je révèle le nouveau rôle de Rad52 dans l'orchestration du redémarrage de la fourche dans le nucléoplasme, un rôle qui implique son activité SSA (single strand annealing). Pris ensemble, mes résultats suggèrent deux aspects. Une partie souligne comment la SUMOylation régulée par Slx8 STUbL favorise la maintenance du centromère. L'autre partie élucide le “contrôle SUMO” des voies alternatives de redémarrage de fourches résolues dans l'espace nucléaire.
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Origine Version validée par le jury (STAR)

Dates et versions

tel-04892291 , version 1 (16-01-2025)

Identifiants

  • HAL Id : tel-04892291 , version 1

Citer

Shrena Chakraborty. Multifaceted role of SUMOylation in maintaining centromere biology and regulation of replication fork restart in Schizosaccharomyces pombe. Genetics. Université Paris-Saclay, 2024. English. ⟨NNT : 2024UPASL069⟩. ⟨tel-04892291⟩
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